系统学习单细胞转录组测序scRNA-Seq(二)
大神一句话，菜鸟跑半年。我不是大神，但我可以缩短你走弯路的半年~
就像歌儿唱的那样，如果你不知道该往哪儿走，就留在这学点生信好不好~
这里有豆豆和花花的学习历程，从新手到进阶，生信路上有你有我！
豆豆写于19.3.16
看了一篇综述，又加了一些扩展知识
文章
这是一篇2017发表在Genome Medicine上的文章A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications
背景
单细胞测序：《Nature Methods》2013年度技术；《Nature》2017年7月刊的封面推荐 ；《Science》2018十大科学突破榜首
研究细胞的方法：基因组DNA序列（碱基如何排列、各个序列的丰度）、染色质结构（常听说的3C、4C、5C、HiC等）、mRNA序列（排列与丰度）、非编码RNA、蛋白表达、蛋白修饰、细胞代谢【因此不只有scRNA，还有sc基因组、sc表观组】
一个细胞中的待研究分子是微量的，因此我们一般使用几千细胞或直接取组织（上千万甚至上亿），这样就可以积累足够的分子信息，可以开展 Genome-wide association studies (GWASs) 、鉴定SNPs
主要做什么：分离新细胞亚群、构建细胞间互作网络、体内与体外实验反应、细胞在不同器官的情况、不同人群比较、不同物种比较
总体≠个体：细胞异质性的存在（受精卵发育成个体，最终去向十分多样=》肌肉细胞、神经细胞等等，why？；肿块中心、周围、转移中的细胞各异，分离出来判断疗法有效性）
挑战：同时检查单个细胞中表达的数千种蛋白质（蛋白组研究范畴），这个完整性有待提高
名词
Barcoding
之前做单细胞，真的是一个个细胞取出来，然后独立构建文库测序（比如：流式细胞术、激光捕获显微切割LCM=》组织切片），但是这通量非常低（有点Sanger测序和二代测序对比的感觉）。
后来发展出高通量的方法，主要是给每个细胞加上独一无二的DNA序列（就是条形码barcode，就是为了识别），然后测序时将相同的barcode序列归为同一个细胞来源
单细胞转录组可以在polyT引物5'端加上barcode；单细胞基因组目前主要利用高效转座酶（transposase）Tn5实现
Spike-in
Spike-ins can be used for assessing the level of technical variability and for identifying genes with a high degree of biological variability
每个细胞都是独特的，和普通的Bulk RNA-seq不同，材料不容易获得，不太好做重复，因此通过生物学重复来评价技术手段/数据质量的方法不靠谱。
但是数据质量还是需要评价的，那么就通过向每个细胞裂解液中加入已知序列与一定数量的合成mRNA，例如 external RNA control consortium (ERCC)【翻译的话，姑且翻译成：外源RNA对照联盟】开发的“内参”，可以根据RNA读数判断样本间差异
高ERCC含量与低质量数据相关
但是使用spike-in也有一些问题要注意：
has to carefully calibrate the concentration that results in an optimal fraction of reads from the spike-ins
spike-in mixes are sensitive to degradation
captured less efficiently than endogenous transcripts
Spike-in不适用于droplet-seq的方法
UMI( Unique molecular identifier )
barcoding的变体，待扩增的RNA分子用随机n-mer寡核苷酸标记。设计不同标签的数量，大大超过待扩增的转录本，产生独特标记的分子，并允许控制扩增偏差【例如10-mer的UMI，就会有 4的十次方 约等于100万种变化】
UMI是一段随机序列，每一个DNA分子都有自己的UMI序列。可以大大降低PCR误差（比如：原来两个样本中某基因表达量相同，但是由于两个样本扩增效率不同，样本1为99%，样本2只有95%，那么同时扩增40个循环，这同一个基因就有了
0.99^40 / 0.95^40 = 5.2倍差异，因此本来没有差异也会因为外界因素扩增效率的影响而产生“假阳性”）UMI只用在3'转录本测序的方法中，如CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq
Dropout
基因在一个细胞中有表达，但在另一个细胞中未检测到（按照道理，每个基因应该都可以检测到，只是表达量多少）
可能源于RNA总量少导致扩增建库丢失 或者 RNA表达随机性
Mass cytometry
基于流式细胞法和质谱，其中使用元素标签标记的抗体检测蛋白质表达 - 允许在一次实验中对数千个单细胞上的数十种蛋白质进行平行测定
Split-pooling
(Rosenberg et al. ) combinatorial barcoding to profile single-cell transcriptomes without requiring the physical isolation of each cell
https://www.rna-seqblog.com/split-seq-single-cell-profiling-with-split-pool-barcoding/
Basic step
The first, and most important, step in conducting scRNA-seq has been the effective isolation of viable, single cells from the tissue of interest
Next, isolated individual cells are lysed to allow capture of as many RNA molecules as possible.
Next, poly[T]-primed mRNA is converted to complementary DNA (cDNA) by a reverse transcriptase.
Then, amplified and tagged cDNAfrom every cell is pooled and sequenced by NGS.
Types of material
- 理论上，任何真核生物细胞都可以
- Primary cells
胚胎 embryo
肿瘤 tumours
神经 nervous system
造血 haematopoietically derived cells
- The Human Cell Atlas
2017年启动，“媲美人类基因组计划”，核心技术=》单细胞组学
对人类37万亿个细胞进行细胞采集、分类和绘图，侧重描绘组织，而不是整个器官；后期阶段可以纳入器官及感兴趣的疾病小群体
2018.3.8，Sanger研究所宣布人类发育细胞图谱（Human Developmental Cell Atlas ，HDCA）的初步项目25万个发育细胞测序完成
补充：测序平台
10X Genomics
2016.2推出 Chromium；
通量高（7分钟内完成100~80,000个细胞的捕获），周期短，成本低，细胞捕获效率高（单个样本细胞捕获率高达65%）；细胞活性要求>90% =》 适用于发现新细胞
横向孔道逐个导入凝胶微珠Gel beads =》 第一个纵向道输入细胞 =》Gel吸附细胞=》微流控技术送到第二个纵向通道（“油tube”）=》油滴GEMs 【因此，一个油滴就是一个Gel bead，也就是一个细胞】=》收集到EP管 =》每个Gel bead表明都放满了各不相同的Barcode和UMI序列+polyT =》细胞裂解，polyT抓取mRNA的3'polyA
BD Rhapsody
分子标签技术（每个转录本标记特异性分子标签）=》单细胞水平上基因表达谱的绝对定量
单次实验可制备100-10000个单细胞文库
CytoSeq特有的蜂窝板技术（20W+的微孔），避免了10X中存在的概率碰撞影响捕获效率问题
可以多样本混合捕获；成像系统；转录组-蛋白组联合分析
Wafergen公司 ICELL8
基于微流控芯片，5184个反应孔
每次运行可分离500-1000个细胞
捕获效率为30%，成本相对较低
Fluidigm公司C1
通量低、成本高（2000-3000细胞需要18000-100000美元）、周期慢
同时捕获96个细胞
全长转录组
llumina Bio-Rad
ddSEQ
一次性检测8个样本，每个样本可以得到500~10000个细胞
组织功能、病情进展和治疗反应方面的协同作用
捕获效率低，仅为3%；成本低
1CellBio => InDrop
Dolomite => µEncapsulator
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